The effects of Electro-Acupuncture combined with buprenorphine on expresion of substance P and Calcitonin gene-related peptide in spinal dorsal horn in CFA rats
FAN long,WANG Guolin. Department of Anesthesiology, General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin300052, China. 
        Abstract Objective : To observe the effects of acupuncture combined with 
        基金项目：天津自然科学基金资助项目（043608911）
        作者单位：天津医科大学总医院麻醉科，范隆现在北京首都医科大学宣武医院麻醉科
        通讯作者：王国林，天津医科大学总医院，邮编：300052，E-mail:Wang_guolin@hotmail.com,           

         buprenorphine on expresion of substance P and Calcitonin gene-related peptide in spinal dorsal horn in CFA rats.Method : 30 SD rats were devided into 5 groups: control group; CFA group; EA group;buprenorphine group; EA+buprenorphine group. To establish chronic pain model, 50μl Complete Freund’s adjuvant (CFA) was injected into tibio-tarsal joint of rat in each group except for group A. Buprenorphine was injected by intrathecal route. The change of hyperalgesia score was observed by recording the difference of paw withdral lantency between two hind limbs in hot plate experiment.Immunohistochemistry and computer image analysis system were used to observe the expression of SP and CGRP in spinal dorsal horn of rats. Results : In all the treatment groups, hyperalgesia scores were significantly elevated（P <0.05）, and the expression of SP and CGRP in spinal dorsal horn were significantly decreased(P<0.05). Conclusion :① EA or intrathecal injection of buprenorphine is effective on elevating hyperalgesia score, and decreasing the expresion of SP and CGRP in spinal dorsal horn. ② Compared with buprenorphine treatment, combination treatment with EA and buprenorphine is much more effective .③ Positive corelationship between SP and CGRP is found.
Key word : Pain, substance P ;Calcitonin gene-related peptide ; arthritic rat ; hyperalgesia score ; Electro-Acupuncture ; buprenorphine

        丁丙诺啡是阿片受体激动-拮抗剂，可激动μ受体、κ受体，具有镇痛强度大、不易产生耐受性、成瘾性的优点，被广泛应用于慢性疼痛治疗。电针作为祖国传统医学与现代技术结合的产物，可通过减少脊髓ＳＰ释放量缓解慢性疼痛[1]。相关研究表明，电针的作用主要靠激活μ、δ受体而与κ受体无关[2]。但同时有研究发现，脊髓强啡肽/κ受体系统的激活程度直接关系在慢性炎症痛行为评分 [1]。那么，电针和丁丙诺啡合用治疗慢性炎性疼痛能否产生协同效应？其神经生物学机制是否与改变脊髓背角SP、CGRP表达相关？有关问题在国内外尚未见系统研究。本研究拟观察丁丙诺啡与电针对佐剂致炎大鼠脊髓背角SP、CGRP表达的影响，并探讨其可能的镇痛机制。

        材 料 与 方 法
        健康SD大鼠30只，雄性，月龄8个月，体重180~220g，，天津市药物研究院提供和饲养。完全弗氏佐剂：（美国Sigma公司，批号80K8926）产品；丁丙诺啡（天津药物研究院药业有限公司，批号010802）：抗体：一抗：SP、CGRP，均为兔抗大鼠抗体；二抗：羊抗兔抗体，（Senta cluz公司，美国）；LH202H韩氏穴位神经刺激仪（(北京华卫产业开发公司)；YLS-6B智能热板仪（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司）；桶形大鼠固定器（江苏省张家港市三兴教具厂）； CMIAS-多功能真彩色病理图象分析系统（北京麦克奥迪图像技术有限公司）等。
        建立完全弗氏佐剂致炎动物模型 依照butler[3]的方法建立单关节炎大鼠模型。以35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠俯卧位固定，用75%酒精将右侧外踝周围皮肤消毒，从外踝后外侧凹陷处将胰岛素注射器针头刺入皮下，然后转向足尖部,刺进胫腓骨和距骨之间的踝关节腔，进针深度约5mm。施加压力，注入CFA50μl。拔针后用干棉球轻压片刻，避免药液沿针孔外溢。 注射第4天用于实验。
        大鼠椎管内置管的方法 按照本实验室改进的杨建平等的方法[4，5]， 进行鞘内置管，以脑脊液外溢为置管成功标志。
        椎管内注药方法 将大鼠置于固定器内，从固定器的颈部开口处将导管引出，消毒管口，用BD公司的胰岛素注射器连接导管，向椎管内注射。先注入5μl生理盐水，检查鞘内导管通畅情况，再注射丁丙诺啡1.5μg ，20μl（D组，E组）注药后以5μl生理盐水注入，冲净导管。。丁丙诺啡剂量参照Gopi A[6]等实验中最低有效剂量。
        实验动物分组 30只大鼠随机分为5组，每组6只。正常对照组； 鞘内置管，CFA致痛后椎管内注入生理盐水组； 椎管内置入导管，CFA致痛后电针处理组； 椎管内置入导管，CFA致痛后,每天1次,连续7d向椎管内注入丁丙诺啡1.5μg（20μ l）组；椎管内置入导管，CFA致痛后椎管内注入丁丙诺啡1.5μg+电针镇痛组
电针方法 分别于CFA致痛后第4天至第10天进行隔日电针治疗。安静环境中，室温20±2oC，将大鼠置于固定器内，两后肢暴露于外，待大鼠安静20min后，将针刺入大鼠左侧“阳陵泉”和“足三里”穴，连接多功能电针治疗仪给予“疏密波”刺激 ，疏波频率2Hz,密波频率100 Hz，强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜（≤2mA,持续30 min）。
        痛敏分数测试 开始实验后，每日9：00AM在室温20±2oC的安静环境中，采用热板仪测定大鼠双后肢缩脚潜伏期（paw withdrawal latency,PWL）,以左右缩脚潜伏期的差值（致炎侧−对照侧）作为痛敏分数（Hyperalgesia,秒，s）,每间隔10分钟测定一次，取三次测定数的平均值作为测定结果。为防止大鼠烫伤，将PWL上限值定为30s。
        标本制备和免疫组化方法 10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射,麻醉大鼠，仰卧位固定，开胸经左心室插管至升主动脉，以4%多聚甲醛进行灌注，取大鼠脊髓L4-6节段，在灌注液中固定24h。经梯度酒精脱水，二甲苯透明石蜡包埋，连续冠状切片，切片厚5μm。切片常规脱蜡至水处理后，在0.01%PBS内浸泡2min；浸入0.01 mmol/L枸橼酸盐缓冲液（pH7.6），微波炉中火加热10min，3%双氧水室温孵育10min； 滴加I抗，湿盒孵育，4oC度冰箱过夜；滴加II抗，37oC恒温箱孵育45min。滴加DAB，室温显色，镜下控制显色时间，PBS洗涤终止反应。以上各步间用0.01%PBS冲洗浸泡5min。常规脱水、透明、封片，显微镜观察。每种抗体均用与一抗血清浓度相同的正常羊血清代替一抗血清进行阴性对照，结果均为阴性。SP、CGRP表达阳性神经纤维和终末在脊髓背角呈棕色颗粒状，以多功能真彩色病理图象分析系统分析处理。
        统计学处理 所有标本免疫组织化学图象均以用SPSS 11.5 FOR WIN 统计软件，进行方差分析，非正态分布采用秩和检验。计量资料以均数+标准差（ ）表示。组内比较采用Student-Newman-Keuls方法；各组间比较采用单因素方差分析； SP、CGRP间采用直线相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
        结 果
        注射CFA后（d）痛敏分数绝对值的比较见表1， 各组SP、CGRP积分光密度值见表2。

        10 Dun NJ, Dun SL, Wu SY.Endomorphins: localization, release and action on rat dorsal horn neurons. J Biomed Sci, 2000 ,7(3):213-20.
        11 Walker JS, Scott C, Bush KA. Effects of the peripherally selective kappa-opioid asimadoline, on substance Pand CGRP mRNA expression in chronic arthritis of the rat. Neuropeptides, 2000 ,34(3-4):193-202
        12 Paola Petrillo, Ornella Angelici, Sharon Bingham.Evidence for a selective role of the delta-opioid agonist [8R-(4bS*,8aalpha,8abeta, 12bbeta)]7,10-Dimethyl-1-methoxy-11-(2-methylpropyl)oxycarbonyl 5,6,7,8,12,12b-hexahydro-(9H)-4,8-methanobenzofuro[3,2-e]pyrrolo[2,3-g]isoquinoline hydrochloride (SB-235863) in blocking hyperalgesia associated with inflammatory and neuropathic pain responses. J Pharmacol Exp Ther,2003 ,307(3):1079-89.
        13Defrin R,Ariel E,Peretz C.Segmental noxious versus innocuous electrical stimulation for chronic pain relief and the effect of fading sensation during treatment. Pain. 2005 May;115(1-2):152-60.
        14 Guo HF, Wang XM, Tian JH, et al. 2 Hz and 100 Hz electroacupuncture accelerate the expression of genes encoding three opioid peptides in the rat brain.Sheng Li Xue Bao, 1997 ,49(2):121-7.
        15韩济生.针刺镇痛频率特异性的进一步证明.针刺研究,2001,26(3):224～227.
        16富　歆,　王彦青,　吴根诚。不同条件电针及其与曲马多合用对佐剂关节炎大鼠镇痛作用的比较。ShanghaiJAcu-mox, 2003，22,14-18。
        17宁云，罗非.不同部位体表电刺激治疗大鼠单发佐剂关节炎的疗效差异.北京大学学报：医学版,2001，33（1）：46-49.。
        18 Huang C, Hu ZP, Long H.Attenuation of mechanical but not thermal hyperalgesia by electroacupuncturewith the involvement of opioids in rat model of chronic inflammatory pain.Brain Res Bull， 2004， 63(2):99-103. 
       

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