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<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /> RNAi Used for Study and Therapy of Chronic Pain 吴飞翔 吴军珍 俞卫锋 第二军医大学东方肝胆外科医院麻醉科，上海 200438 Fei－xiang Wu，Jun－zhen Wu，Wei－feng Yu Department of Anesthesiology，Eastern <?xml:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags" /> ABSTRACT Chronic pain is a major socio－economic burden，mechanism of which remains unknown. It is now focused on searching new explain of chronic pain and developing more efficacious therapies. A recent development involving RNA interference（RNAi）in a pathophysiological model of chronic pain highlighted a novel approach to potential treatment in humans. Delivery of oligonucleotides led to a potent and highly selective degradation of a target mRNA and produced a measurable abrogation in pain－related behaviour. It can also be used to search for new possible gene in chronic pain pathway. This review will discuss the potential of small interfering RNA（siRNA）in the treatment of chronic pain by evaluating points of intervention in chronic pain pathways that may be amenable to siRNA application. Key words：RNA interference；Chronic pain；siRNA；P2X3 receptor RNA干扰是近年来发展起来的一种新的技术，可特异性降解mRNA，在肿瘤机制及治疗、免疫等各个方面都有广泛的应用，主要用于“敲低”靶基因和发现新基因。2003年，靶向P2X3受体siRNA?内注射有效降低机械性痛觉过敏和触觉超敏，为其在慢性疼痛研究分析以及治疗开辟了一条新的途径。 |
<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /> 一、RNA干扰及其作用机制 RNA干扰（RNA interference，RNAi）就是利用双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的过程，即诱导序列特异的转录后基因沉默（post－transcriptional gene silencing，PTGS）[1]。 RNA干扰是由双链RNA诱导的，其作用分起始阶段和效应阶段（initiation and effector steps）[2]。起始阶段，外源导入的双链RNA将被RNaseⅢ家族中的一个能够特异性识别双链RNA的酶Dicer[3]，以ATP依赖的方式逐步切割为21～23nt的小分子干扰RNA片段（small interfering RNAs，siRNA）。siRNA 3’末端有2～3个游离末配对的核苷酸（dTdT或UU）。在效应阶段，siRNA双链与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物（RNA－induced silencing complex，RISC）。RISC以ATP依赖性方式激活，RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义链，反义链仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标RNA结合，在核酸内切酶的作用下，自距离siRNA 3’端12个碱基的位置处将靶mRNA切断，从而阻断基因表达[2]。siRNA还可以作为一种特殊的引物，在RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA分子，后者又可被RISC降解为新的siRNA，新生成的siRNA又进入上述循环，这一过程被称为随机降解性聚合酶链反应（random degradative PCR）[2]。新生的dsRNA反复合成与降解，不断形成新的siRNA，从而使靶mRNA不断减少，导致目的基因沉默，呈现RNAi现象[4，5]。 二、慢性疼痛及其病理生理 慢性疼痛，指在引起急性疼痛的因素消退以后仍然持续存在的疼痛，或伴随慢性原始病程产生的疼痛，诸如创伤或损伤、偏头痛、各类关节炎、血管神经疾病和癌症的伴随症状，其时间通常持续三个月以上。 慢性疼痛的特点为“周围敏化”，表现为痛觉过敏，即C纤维激活的阈值降低，对轻伤害性刺激的反应强化和延长。周围敏化可由神经或组织损伤后细胞释放的介质引起。外周机制使初级传入神经异常激活增多，从而增加了向脊髓传导的信号流，最终导致兴奋性的改变而引起“中枢敏化”的现象。而“中枢敏化”是二级神经元（位于脊髓深层和大脑）综合反应的改变，也通常被认为是“超敏”（对非伤害性刺激表现出疼痛反应）的基础[6]。慢性疼痛是神经元可塑性变化的表现形式之一。神经元可塑性变化主要有两种形式：调制（modulation）和改造（modification）。调制是外周初级感觉神经元和中枢伤害感受性神经元的可逆性变化，主要通过胞内信号转导系统活化使受体／离子通道磷酸化或产生翻译后作用改变膜兴奋性；改造是递质、离子通道表达数量或结构上长时间的改变并与神经元生存有关，基因的表达可能发生改变[7]。
三、RNA干扰技术在慢性疼痛机制研究分析中的应用 慢性疼痛发病机制的网络错综复杂，涉及众多的受体、通道及蛋白的相互作用，很多基因在其中的功能还未明了。P2X3受体、Nav1.8通道应用siRNA敲低其基因水平，从另一方面证实它们在慢性疼痛中的作用，这也提示可以用RNA干扰技术来研究慢性疼痛中的某些基因的功能，甚至发现某些未知基因在慢性疼痛中的作用[8]。 |
<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /> 1. RNA干扰技术在研究慢性疼痛基因功能中的应用 RNA干扰技术已经成功地用于各种生物体、各种组织细胞的基因功能研究，包括各种植物、真菌、低等和高等动物，RNA干扰技术在大规模基因功能研究中有广泛的应用前景。研究基因功能的传统方法有定向克隆及转基因技术等正向遗传学（forward genetics）方法，以及基因敲除、反义技术及核酶技术等反向遗传学（reverse genetics）方法等。定向克隆和基因敲除有周期长、成本和技术要求高等缺点。反义技术及核酶技术的抑制基因表达效率低，远远满足不了大规模基因功能研究的需要。过去明确一个哺乳动物细胞基因如何关闭要花费6个月，而利用RNA干扰技术，一个星期就能明确10个基因的关闭[9]。目前，用RNA干扰研究其他生物体基因功能仍然以小规模或单基因的操作模式为主，这种模式显然不能满足功能基因组研究的需要。2000年，Fraser等[10]构建dsRNA表达文库成功应用于线虫功能基因组分布中，对于慢性疼痛相关基因功能的研究具有很好的借鉴作用。 2. RNA干扰技术与基因芯片技术结合用于慢性疼痛靶基因确定 基因芯片技术能够高通量地检测在特定条件下细胞基因的表达情况，Mousses等[11]巧妙地将RNAi与基因芯片技术有机地结合在一起，建立RNAi微阵列技术。用siRNA－－脂质体复合物点在玻璃片上制备成含siRNA的微阵列，将细胞铺在玻璃片上进行反向转染，然后整合其他检测技术（如化学发光、显色、放射活性检测等）对RNAi结果进行分析。由于在一张玻璃片上可同时进行上万个不同的siRNA点的分析，因此能够高通量地研究基因功能，确定慢性疼痛相关的靶基因。通常，一个基因的编码序列可以设计出多条siRNA，但每条siRNA沉默基因的效能参差不齐，不同的siRNA与其效能之间没有明确的规律可循，常规的、盲目的siRNA筛选方法效率低下，严重阻碍了RNAi的应用[12]。为此，Mittal实验室开发了一种能够针对任意基因快速筛选有效的siRNA或短发夹RNA（short hairpin shRNA）的半定量方法。Mittal的方法与Mousses不谋而合，同样是基于微阵列的反向转染，通过检测报告基因的表达水平，判断不同siRNA或shRNA沉默目的基因的效能。因此，基因芯片技术与RNA干扰技术巧妙结合可确定慢性疼痛的可能靶位，具有高效、省时的特点。 四、RNA干扰技术在慢性疼痛治疗中的干预靶位 理论上讲，在慢性疼痛通路中兴奋性增高的基因都可能成为RNA干扰靶位，从而降低其兴奋性，达到治疗目的。siRNA用于疼痛治疗还处于探索阶段，关于siRNA介导的下调疼痛基因方面的文献较少，下面主要就已经报道的siRNA干预靶位，以及根据反义寡核苷酸（antisense oligonudeotides ASOs）对疼痛基因下调和某些药物拮抗剂对疼痛靶位拮抗的提示，对siRNA的可能靶位加以阐述。 1. 外周位点 初级传入神经外周末稍受体或离子通道的选择性下调会导致炎症介质（ATP、缓激肽、氢离子、神经生长因子、前列腺素）的激活减少。最近，用与ATP门控阳离子通道P2X3完全互补的21个核苷酸siRNA来靶向P2X3受体，经腰椎留置管注射于小鼠鞘内，发现与对照组相比，P2X3 siRNA处理组大鼠后爪注射P2X3受体激动剂α，β－亚甲基ATP引起的机械性痛觉过敏和触觉超敏明显减轻。在分子水平，DRG中的P2X3受体mRNA和背角初级传入末稍中的P2X3受体蛋白也都大大减少。大鼠部分坐骨神经结扎模型中，P2X3 siRNA注射两天后，机械性痛觉过敏和触觉超敏都逆转50％，且效果持续存在[13，14]。此实验开辟了一条用siRNA作为遗传工具治疗慢性疼痛的新道路。 |
<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /> 13. Hemmings－Mieszczak M，Dorn G，Patel S，Wotherspon G，Natt FJ，et al.Independent combinatorial effect of antisense oligonucleotides and RNAi－mediated specific inhibition of the recombinant rat P2X3 receptor. Nucleic Acids Res，2003，31：2117－2126. 14. Gabriele Dorn，Sadhana Patel1，Glen Wotherspoon.SiRNA relieves chronic neuropathic pain.Nucleic Acids Res，2004，32：e49. 15. Grünweller A，Wyszko E，Bieber B.Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids，2'－O－methyl RNA，phosphorothioates and small interfering RNA.Nucleic Acids Res，2003，31：3185－3193. 16. Lai J，Porreca F，Hunter J，et al.Voltage－gated sodium channels and hyperalgesia. Ann Rev Pharmacol Toxico，2004，44：371－397. 17. Mikami M，Yang J.Short hairpin RNA－mediated selective knockdown of NaV1.8 tetrodotoxin－resistant voltage－gated sodium channel in dorsal root ganglion neurons. Anesthesilolgy，2005，103（4） ：828－36. 18. Miljanich GP.Ziconotide：neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain.Curr Med Chem，2004，11：3029－40. 19. Tan PH，Yang LC，Shih HC，et al.Gene knockdown with intrathecal siRNA of NMDA receptor NR2B subunit reduces formalin－induced nociception in the rat.Gene Ther，2005，12：59－66. 20. Hains B，Klein J，Saab C，et al.Upregulation of sodium channel Nav1.3 and functional involvement in neuronal hyperexcitability associated with central neuropathic pain after spinal cord injury.J Neurosci，2003，23：8881－8892. 21. Zhang WB，Zhang Z，Ni YX，et al. A novel function of Goα：Mediation of extracellular signal－regulated kinase activation by opioid receptors in neural cells.J Neurochem.2003，86：1213－1222. 22. Zhang Y，Boado RJ，Pardridge WM.In vivo knockdown of gene expression in brain cancer with intravenous RNAi in adult rats.J Gene Med，2003，5：1039－1045. |