Effects of Ropivacaine on Voltage-dependent Sodium Channels in Cultured Rat Hippocampal Neurons<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

ABSTRACT

Objective: Effects of ropivacaine on voltage-dependent sodium channels in cultured rat hippocampal neurons were investigated, and the relationship between adverse effects of local anesthetic on central nervous system and voltage-depentdent sodium channels were identified.

Methods: Effects of ropivacaine on voltage-dependent sodium channels in cultured hippocampal neurons were observed using whole cell patch clamp technique.

Results: As the holding potential was-90mv,1,10,50,100,1000,2000umol.L-1 ropivacaine reduced sodium peak currents by 7.35±2.29%,13.91±4.68%,32.67±5.11%,42.49±6.03%,78.59±7.98%,86.03±8.27%, (P<0.001), repectively. The IC50 was 157.66±22.49umol.L-1. Analysis of variance of single factor showed that the inhibitory effects of ropivacaine on sodium currents were significantly different in different holding potentials (P<0.001), i.e. the inhibitory effects on sodium currents were voltage-dependent.

Conclusions: Ropivacaine had significant depressing effects on sodium current in a dose-dependent and voltage-dependent way. It is suggested that adverse effects of local anesthetic on central nervous system was related to the depression of sodium channels in hippocampal neurons.
Key Words: Sodium channel, Voltage-dependent; Hippocampal neurons;Amides
　　罗哌卡因是一新型酰胺类局麻药，与布吡卡因相比，具有运动阻滞轻，心肌毒性作用低等优点[1]。然而，当其被误注血管或累积用药量超过正常范围，会出现中枢神经系统的中毒症状，初期表现为口唇麻木，耳鸣，视觉模糊，躁动不安，抽搐，甚至产生惊劂，如果不进行有效处理，最终可导致昏迷，发展为呼吸系统和心血管系统抑制。研究提示，中毒后期的抑制性症状可能与局麻药阻断钠通道有关[2]。钠通道的几种亚型广泛存在于中枢神经系统，它的生理作用在于产生快速去极化的动作电位，当处于激活状态下，钠通道开放，允许钠离子沿着电化学梯度流入神经细胞内部[3]。罗哌卡因用药过量导致中枢神经系统中毒症状是否与电压依赖性钠通道有关，至今尚不清楚，本研究拟通过测定罗哌卡因对大鼠海马神经元电压依赖性钠通道的作用，明确局麻药中毒的细胞机制。

材料和方法

1． 海马神经元的分散和培养
　　取新生Wistar大鼠，用75%乙醇消毒。在无菌条件下断头、取脑，解剖镜下分离出海马，用0.25%胰蛋白酶（37℃）消化30min，吹打分散细胞悬液，将细胞按1×105ml-1的密度接种在事先涂有多聚赖氨酸的35mm培养皿中，置于36℃10的二氧化碳培养箱中过夜，24h后更换培养基，将种植液换成2ml饲养液。以后每3天半量换液一次，培养细胞在8~12天期间用于膜片钳实验。为抑制非神经元过度增殖，在培养的第3天向培养基中加入适量阿糖胞苷（每皿中加阿糖胞苷储备液6μl,终浓度为3μg.ml-1）。

2． 记录液配制[4]
　　电极内液（mM）：CsCl 70，CsF 70, TEACl 10, MaCl22, EGTA 11, ATP-Na2 3,HEPES 10, pH值7.2。细胞外液（mM）: Nacl 140, KCl 5, MgCl2l, CaCl22，Glu-cose 10,HEPES 10, pH值7.2.
3． 全细胞记录、数据采集
　　记录电极采用水平微电极拉制仪（Sachs-Flaming PC-84,USA）拉制，电极电阻2-5M“O”。给药电极与BH-2压力注射仪（USA）相连，采用气压（10-30kPa）喷射给药法，给药电极与记录细胞的距离为50-100μm，给药持续时间1s。
　　在20-23℃条件下采用全细胞膜片钳记录钠电流，电极尖端与细胞膜之间形成高阻封执着后，负压破膜，进行串联电阻和膜电容补偿，低通贝塞尔-3dB滤波频率为2kHz，电信号经Axonpatch1-D(USA)膜片钳放大器放大后通过IL-1接口输入计算机clampex程序中。
4． 统计分析
　　采用clampfit8.0和origin6.0软件进行数据分析和作图。数据以标准差±均值表示。统计学处理采用方差分析和配对t检验。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

结果

1． 罗哌卡因对钠电流的抑制作用
　　图1为罗哌卡因对钠电流抑制作用的浓度-效应曲线，在锘制电压为-90mv的条件下，浓度为1，10，50，100，1000，2000umol.L-1的罗哌卡因对钠电流峰值的抑制率分别为7.35±2,29%,13.91±4.68%,32.67±5.11%,42.69±6.03%,78.95±7.98%,86.03±8.27% (P<0.001)。 每个浓度观察7个神经元。罗哌卡因对钠电流的抑制作用逐渐增强。其IC50（50%的钠通道电流峰值受抑制时的罗哌卡因浓度）为157.66±22.49umol.L-1。罗哌卡因对钠电流的抑制作用均是可逆的，大部分神经元在给药后1-2min可以记录到恢复完全的电流-电压曲线。
2． 罗哌卡因对钠通道电流I-V曲线的影响
　　将钳制电压设定为-90mv，去极化到+20mv，刺激阶梯为10mv，共记录5个神经元，得到图2所示的I-V曲线。单因素方差分析表明，罗哌卡因在不同锘制电压下对钠电流峰值的抑制率有显著差别（P<0.001），即对钠电流的抑制作用具有电压依赖性。
         

讨论<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

　　大量研究表明局麻药对中枢神经系统的副作用与离子通道的改变有关。研究表明，罗哌卡因和布吡卡因对大鼠脊髓背角神经元的钙通道具有明显的抑制作用[5]，表明钙通道参与了局麻药致中枢神经系统的毒性作用。
　　电生理学和人分子生物学实验提示神经元内存在钠通道的几种亚型。大鼠脑内至少存在三种钠通道的信使RNA，并且通过实验手段已经获取了这三种钠通道的cDNAC 以及各自的原始序列。钠通道由α亚单位组成，后者包括四种重复的氨基酸序列。钠通道由α亚单位组成，后者包括四种重复的氨基酸序列，重复序列中又包括六个跨膜疏水区，其中S4区域为钠通道的电压传感器，用来探测膜电场的变化，同时使通道蛋白产生结构上的变化。当处于激活状态下，钠道开放产生快速去极化的动作单位[3]。
　　本研究结果表明，罗哌卡因在50-2000umol.L-1的浓度范围内对钠通道电流具有明显的抑制作用，并且具有浓度依赖性，随药物浓度增加，对钠电流的抑制作用增强。以3mg.kg-1.min-1的速度给大鼠静脉注射罗哌卡因，发现平均动脉压下降50%时罗哌卡因的动脉血浆浓度为20ug.ml-1[6]，换算为摩尔浓度为61umol.L-1,该血药浓度正是实验中药物对钠电流具有显著作用的浓度范围，表明局麻药通过作用于神经细胞的钠通道，抑制神经元的兴奋性，从而引起血压下降，呼吸抑制等症状。因此，我们认为钠通道参与了局麻药致中枢神经系统的毒性作用。
　　实验表明罗哌卡因对钠通道I-V曲线的抑制作用为电压依赖性，说明罗哌卡因的作用位点在钠通道内部，这一发现为进一步研究局麻药对钠道的作用机制提供了重要的线索。

参考文献
1． Anthony M. Diana F. Ropivacaine: A review of its pharmacology and therapeutic use in regional anaesthesia. Drugs196sep;52(3):429-449.
2． Mccaughey W. Adverse effects of local anaesthetics. Drug Safety 1992,7(3): 178-189.
3． Wann KT. Neuronal sodium and potassium channels: structure and function. Br Anaesth. 1993; 71: 2-14.
4． 王维蓁，吴新民.利多卡因对大鼠海马椎体神经元电压依赖性钠通道的作用，中华麻醉学会杂<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />