Experimental Study of Protective Effect of Several Drugs on Myocardium Ischemia / Reperfusion Injury<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

王成夭Chengyao Wang　李建国Jianguo Li　陈　锋Feng Chen　王焱林Yanlin Wang 　张宗泽Zongze Zhang　郑勇萍Yongping Zheng　刘晓荣Xiaorong Liu　李翠荣Cuirong Li
武汉大学中南医院麻醉学教研室  430071
Chimayo Wang, Jingo Li, Feng Chen, Yanlin Wang, Zongze Zhang , Yongping Zheng , Xiaorong Liu, Cuirong Li.
Department of Anesthesiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University , Wuhan 430071

ABSTRACT

Objective:To investigate the mechanism of Angelica, Panax Notoginse Saponinse (PNS) and cycle Adenosine Monphosphate (cAMP) protecting myocardium from schema reperfusion (I/R) injury.
　Method :Eighty SD rats weighing 220∽280g were anesthetized with intrabdominal sodium pentobarbital(4.5mg/100g).Myocardial I/R model was carried out by left coronary artery subjected to 30 minutes occlusion followed by 2hours reperfusion. Rats were divided into five groups (n=16 in each group): control group A, I/R group B, Angelica group C, PNS group D and c AMP group E .The rats were received intravenous Angelica 0.8m1/100g,PNS15mg/100g and c AMP 0.1mg/100g 5 minutes before induction of isocheim in groups A,B and C, respectively . Malondialdehyde (MDA) content was detected by TBA and super oxide demitasse (SOD) activity was measured by chemical amplification, the expressions of heat shock protein 70(HSP70), protein kinas C (PKC) and Fas, Bcl-2 protein were measured by immunoh is to chemical techniques. Myocardial cells apoptotic index (AI) were detected by TUNEL, and the myocardial ultrastucture was observed under electronic microscope.
　Results: MDA content of myocardium was reduced significantly in group C and group d (P<0.01), but significantly increased in-group B (P<0.01). SOD activity and HSP70 and PKC expression of myocardium in group C and group D were HSP70 and PKC expression of myocardium in group C and group D were higher than that of group B (P<0.01). Under electronic microscope, myocardial ultra structural injury in groups C,D and was significantly improved in comparison with group B .The AI in group B significantly higher than that of group E(P<0.01).The average OD value of Fas  protein was significantly lower in group E than that of group B(P<0.05).The average OD value of Bcl-2 protein in group E significantly increased compared with group B (P<0.01), but was not different from that of group A (P>0.05).
　Conclusion :Angelica and PNS can protect myocardium from isocheimal reperfusion injury by reducing product of oxide free radical, inducing HSP70 expression and modulating PKC expression . C AMP can modulate the expression of Fas and Bcl-2 Protein and inhibit apoptosis to protect myocardium from isocheimal reperfusion injury.
　Key words:Drug; Isocheimal reperfusion, myocardium;Heat shock protein70; Protein kinas C; Apoptosis

材　料　与　方　法<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

　　一、动物模型与分组
　　健康SD大鼠80只，雌雄不限，体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5mg/100g麻醉动物后行气管切接微型呼吸机人工呼吸(呼吸频率60次/分,潮气量２m1/100g, 微型呼吸机由上海第二军医大学生产)，沿胸骨左缘第四肋骨开胸建立左冠状动脉前降支结扎／开放心肌缺血／再灌注模型。将动物随机分成三组：Ａ空白组（n=16只），丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎；Ｂ组缺血／再灌注30min测定MDA及SOD，8只缺血40min／再灌注12min测定HSP70。Ｃ组当归治疗组（n=16只），缺血／再灌注前舌静脉当归注射液0.8m1/100g，其它处理同Ｂ组。Ｄ组PNS组（n=16只），缺血／再灌注前舌静脉注射三七总皂甙１５mg/100g，其处理同Ｂ组。Ｅ组cAMP冶疗组（n=16只），缺血／再灌注前舌静脉当归注射cAMP(0.1mg/100g)，其处理同Ｂ组。
　　二、药物试剂
　　25％当归注射液（湖北医科大学附二院药剂科生产，批号为981109）。PNS由昆是制药有限公司惠赠（滇卫药准准字1996第一流03222号），环磷酸腺苷注射液（商品名美心力，广东江门生物技术中心产品）。原位细胞凋亡试剂盒（POD，为德国Boehringer Mannheim产品），Fas和Bcl-2单克隆抗体、免疫组化试剂盒购自北京中山生物有限公司，抗鼠HSP70抗体购福州迈新公司，抗鼠PKC抗体购北京中山公司。SOD试剂盒及MDA试剂盒购自南京建成生物工程公司。
　　三、观察指标及测定方法
　　取缺血心肌按试剂合说明书提供方法即用化学扩增测定SOD活性，用TBA法测定MDA含量。取心尖以上缺血梗死区横切２mm厚心肌，固定、脱水、浸蜡、切片后，用疫组化SP法观察心肌细胞HSP70和PKC的表达，阳性反应细胞为棕黄色，用HPIAS-1000图象分析系统计算灰度值（反映免疫组化结果的深浅程度，无单位，数值越小，表示颜色越深，阳性程度越高）。再灌注12mim后取心尖以上3mm处2mm*2mm*2mm大小心肌，用戊醛固定后常规电镜切片，在H-600型透射电镜下观察心肌细胞超抽．微结构。心肌凋亡细胞的原位标们检测：采用末端脱氧核苷转移酶（TdT酶）介导的带荧光的Dutp缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）法标记心肌凋亡细胞核中的DNA3'-OH末端。每一标本取３个不同部们的切片各一张，按TUNEL法步骤操作，然后DAB显色、;苏木素复染。上述步骤中不加TdT酶作为阴性对照。光镜下正常心肌细胞胞核呈蓝色；凋亡阴性细胞的胞核为深浅不一的棕褐色。于凋亡阳性细胞分布区域，光镜200倍下随机选择５个视野，对凋亡阳性细胞计数并行计算机图象分析，做半定量测定，以心肌凋亡阳性细胞数占总肌细胞数的非分比作为心肌细胞凋亡指数（apoptoticindex,AI）。Fas、Bcl-2测定：取心尖以上缺血梗死区横切２mm厚心肌，固定、脱水、浸蜡、切片后，用免疫组化ＳＰ法观察细胞Fas、Bcl-2的表达情况，用HPIAS-1000图象分析系统计算灰度值（OD值）作为半定量参数，测量Fas、Bcl-2蛋白含量。
　　四、数据处理
　　每组数据以±s表示，Ａ组与Ｂ组及Ａ组、B组分别与其他组之间采用团本t经验，用SAS6.12软件进行统计分析，Ｐ＜0.05为有统计学差异。

结　果<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

　　一、动物心肌组织MDA含量及SOD活性的变化
　　Ｂ组MDA含量明显高于Ａ组（Ｐ<0.01），SOD活动性显低于Ａ组（Ｐ<0.01）。Ｃ组、Ｄ组与Ａ组比较，MDA、SOD指标无明显差异（Ｐ>0.05）；与Ｂ组比较，MDA含量明显下降（Ｐ<0.01），SOD活动性增加（Ｐ<0.01），见表１。
　　二、动物心肌细胞HSP70的表达变化（见表２）
　　Ｂ组灰度值为182.50０±3.07,与组灰度值180.44±4.30相比较无明显差异（Ｐ>0.05）。Ｃ组、Ｄ组的灰度值为156.17±9.98和143.60±3.87，分别与Ｂ、Ａ两组相比较均有显著性差异（Ｐ<0.01）。
　　三、动物心肌细胞PKC的表达变化（见表２）
　　Ｂ组的PKC灰度值139.83±5.87，与Ａ组114.09±3.59和C组120.14±2.86比较,有显著性差异（Ｐ<0.01）。C组PKC的灰度值与A组比较，无统计学意义，但发现C组的PKC多分布在细胞膜上，A组的PKC多分布在细胞核和细胞浆内。B组PKC的分布与A驵一样，分布在细胞核和细胞浆内。D组的PKC为123.71±13.24与A组比较,无统计学差异（Ｐ>0.05）,与B组比较,有统计学差异（Ｐ<0.01）。
　　四、动物心肌细胞超微结构的变化
　　A组：心肌细胞超微结构正常。B组心肌细胞超微结构损伤严重：心肌纤维断裂、溶解、肌纤维间隙扩大，线粒体明烛肿胀、基质透亮明显增加、嵴断裂、溶解、甚至呈空泡。核膜断裂，呈凹凸不平。C组、D组和E组比较均有明显改善：表现在肌纤维排列基本整齐、规则，线粒体基本完整、嵴清晰、无空泡形成，核膜基本完整，少数线粒体轻肿胀，肌纤维轻度溶解。
　　五、心肌细胞凋亡指数变化
　　B组的凋亡指数(2.23±0.35)明显高于A组的(0.33±0.15；Ｐ<0.01)，E组的凋亡指数(1.23±0.43)显著低于B组（Ｐ<0.01），但仍高于A组（Ｐ<0.01）。见表3。
　　六、Fas、Bcl-2蛋白含量的变化
　　B组Fas的OD值为(0.35±0.06)明显高于A组的(0.26±0.08；Ｐ<0.01)，E组Fas的OD值为(0.30±0.03)显著低于B组（Ｐ<0.05），但仍高于A组（Ｐ<0.05）。B组Bcl-2的OD值为(0.07±0.02)明显低于A组的(0.27±0.01；Ｐ<0.01)和E组(0.28±0.01；Ｐ<0.01)，E组Bcl-2的OD值与A组比较无统计学差异（Ｐ＞0.05）。见表3。

讨　论

一、氧自由基与心肌缺血／再灌注损伤
　　在心血管疾病中，经常发生缺血／再灌注损伤，其机制可能是多因素的，但主要有三个环节：即能量代谢失常、钙超载和氧自由基生成，其中氧自由是造成缺血再灌注损伤的直接原因^[1]。缺血／再灌注过程中，机体可通过多种途径产生氧自由基，氧自由基与生物膜发生一系列反应，可破坏心肌细胞结、损伤心肌细胞膜，产生大量的脂质过氧化物。MDA是氧自由基脂质过氧化的最终产物，SOD是体内清除自由基氧化酶系统的成员之一，因此测定MDA值能反氧自由基的含量和脂质化程度，检测SOD活性能反映机体内抗脂质过氧化的能力。本实验中，缺自再灌注组MDA含量显著增加，SOD活性明降低，说明缺再灌注后产生了大量的氧化自基，并介导了细胞膜中的多种不饱和脂肪酸的过氧化反应，使SOD消耗量增加和氧自由基酶性清除系统遭到损伤，造成心肌细胞超微结构严重破坏。经当归注射液、三七总皂甙和外源性环磷酸腺苷能够清除氧自由基，抑制过氧化物产生，使氧自由基酶性清除系统和心肌细胞超微结构免遭破坏，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。
　　二、热休克蛋白与心肌保护
　　近年来有学者发现，热休克预处理实验动物恢复一定时间后明显减轻缺自／再灌注所致心肌损伤，与热休克诱导心肌合成的一组热休克蛋白（Heat shock proteins,HSPs）或应激蛋白（stress proteins,SP）有关^[2]。其中，HSP70是研究最深入的一种。目前，HSP70对心肌保护作用机制还不十分清楚，一种观点是HSP增强了心肌细胞抗氧化防御能力。Currie等^[3]发现热休克预处理的大鼠心肌组织中SOD和过氧化氢酶活性明显增强，并且用过氧化氢酶抑制剂抵消了HSP70的心肌保护作用，进一步说明了HSP与过氧化氢酶之间的亲密关系。另一种机制是HSP70直接参与新蛋白质的折叠和装配^[2]。HSP作为一种 "分子伴侣"可保持正常蛋白处入功能状态，使遭受破坏的蛋白质解聚，重新折叠成具有生物活动性多肽或蛋白。另外，HSP对心肌保护的作用机制还与细胞内Ca²⁺、三磷酸腺苷（ATP）等的改变有关^[4]。本实验结果显示，缺血／再灌注组心肌细胞HSP表达无明显改变且SOD活性显著降低，而当归注射液和三七总皂甙使心肌细胞HSP表达则明显增强且SOD活性较缺血／再灌注组显著增加，MDA含量显著下降。说明当归和三七总皂甙可以通过增加细胞HSP70的表达发挥抗心肌缺血／再灌注损伤，对心肌具有保护作用。

　　三、蛋白激酶C与与心肌保护
　　PKC是心肌细胞磷脂酰肌醇信号转导系统的重要组成部分。当心肌细胞受到外界信号刺激后，位于细胞膜上的磷脂酶水解膜磷脂产生二酰基甘油（diacylglycerol,DAG）和Ca²⁺协同活化PKC。PKC通过磷酸化众多位于膜上和胞浆内的底物蛋白而发挥广泛的生理作用，调节心肌细胞的代谢和生理功能^[5]。
　　PKC对心肌保护作用的具体机制已有较深入的研究，其机制有：（1）促进腺苷的合成^[1]。（2）激活ATP敏感性钾通道（K_ATP）^[6]。（3）维持Ca²⁺稳态^[7]。通过对心肌细胞PKC 含量和活性的研究，我们发现当归通使PKC活性增强，含量增加，并能使心肌细胞的PKC从细胞核或细胞浆移位到细胞膜上，分布发生改变。提示当归抗心肌缺血／再灌注损伤的作用与蛋白激酶C（PKC）有关。心肌缺血／再灌注损伤破坏了心肌细胞的结构，从而抑制了心细胞PKC的活性。在观察PNS对PKC的表达是否有作用时，结果显示，心肌经缺血／再灌注后胞内的PKC含量均比正常心肌明显减少，可能与缺血／再灌注损伤有关，PNS组的PKC含量虽较正常心肌略低, 但在统计学上无差异。而此组的HSP70明显表达，我们量解为HSP70维持了PKC的空间构象，防止了PKC的降解。
　　四、细胞凋亡与心肌保护
    细胞凋亡是指在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，通过启动内部机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活，导致细胞主动的死亡过程。通常在生理条件下，凋亡作为细胞死亡的一种方式，与细胞增殖一起，通过细胞有序而协调地激活凋亡诱导基因为（Fas、P53等）和或凋亡的规律失常，个体生使命活动就失去了正常的功能，甚至不能存活^[10]。
　　休内和体外的动物实验研究已发现心肌细胞凋亡与心肌缺血／再灌注伤损伤等心血管疾患在着密切关系，并提示了心肌细胞凋亡是再灌注心股损伤的特征之一，可能与自由基诱发有关^[11]。Fliss等证实在缺血和缺血／再灌注大鼠心肌细胞中有典型的凋亡形态改变和DNA梯形格局，认为缺血和缺血／再灌注心肌均可发生细胞凋亡，而且再灌注可加速不可逆转的细胞凋亡^[12]。本实验结果表明，心肌缺血／再灌注过程中细胞凋亡指数上升，Fas蛋白表达增强，Bcl-2蛋白表达减弱，证明细胞凋亡确实参与了心肌缺血／再灌注损伤。
　　环磷酸腺苷（cAMP）是机体内参与物质代谢、调节细胞理化和生物学功能的重要物质。能稳定细胞膜，抑制生物介质的释放，达到扩张平滑肌的作用，因而具有增强心肌收缩力，扩张心肌冠状动脉的作用。已有研究提示注射用cAMP可明显降低缺血／再灌注大鼠血清中脂质过氧化物（LPO）浓度，提高SOD活性，减轻细胞内Ca²⁺超载，具有抗缺血、缺氧、清除氧自由基、保护心肌细胞功能的作用^[7]。本实验证明，（1）缺血／再灌注前表脉注射Camp(lmg/kg)具有保护心肌细胞的作用，表现在心肌细胞超微结构显改善。（2）大鼠心肌缺血／再灌注过程中细胞凋亡指数下降，Fas蛋白表达减弱，Bcl-2蛋白表达增强。表明Camp能抑制细胞发生凋亡，可能与其提高SOD活性，减轻细胞Ca²⁺超载，抗缺血、缺氧、清除氧自由基的作用有关。细胞内Ca²⁺超载减轻，抑制Ca²⁺－Mg²⁺依赖性核酸内切酶的活性；Camp激活线粒体外膜Bcl-2蛋白，通过阻止细胞色素C从线粒体释放到胞质中去，从而抑制Caspase-3的激活，因此抑制细胞凋亡发生。
　　我们的研究发现，当归注射液和三七总甙。提示在心肌皂甙均在心肌缺血／再灌注过程中促进心肌细胞HSP70的表达和较好的清除氧自由基作用，能明显改善心肌超微结构，确实具有抗心肌缺血／再灌注损伤的作用，同当归使心肌细胞内PKC分布发生改变，可能与当归保护了心肌细胞的超微结绝有关。而三七总甙在促进SHP70表达的同进可能维持了PKC的空间构象，防止了PKC的降解，使PKC激活细胞和线粒体的ATP敏感通道，减少再灌注损伤中的钙超载，从而发挥保护心肌的作用。CAMP使大鼠心肌缺血／再灌注过程中细胞凋亡指数下降，的发生。Fas蛋白表达减弱，Bcl-2蛋白表达增强。表明cAMP能抑制心肌缺血／再灌注过程中细胞凋亡的发生。提示在心肌缺血／再灌注损伤中，细胞凋亡是可以预防的。cAMP抑制细胞发生凋亡，可能与其提高SOD活性，减轻细胞内Ca²⁺超载，抗缺血、缺氧、清除氧自由基的作用有关。至于cAMP是如何通过减轻心肌细胞凋亡而起到防冶再灌注损伤的作用，尚需进一步研究。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

参考文献
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