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Effect of intrathecal pumping morphine on spleen T lymphocyte proliferation and NK cell activity in rats

郭曲练  邹望远  王锷  蔡进

GUO Qu－lian，ZOU Wang－yuan，WANG E，et al.Department of Anesthesiology，Xiangya Hospital，Central South University，changsha 410008，China

Abastrat

　　Objective：To evaluate the effct of intrathecal pumping different dosage morphine on cell－mediated immunity.

　　Methods：Forty Sprague－Dawley rats（290±30g）were randomly divided into 8 groups（n＝8 in each group）：saline group（NS），sham control（F），morphine groups：M1group （10μg/h）、M2 group （5μg/h）、M3 group（2.5μg/h）.Which were anesthetized with 10％ Chlroral Hydrate （300～350）mg/kg.A microspinal catheter（inner diameter 0.12mm，outer diameter 0.35mm） was inserted into the lumbar subarachnoid space. After five days，an Alzet? osmotic minipump was connected tightly with a polyurethane catheter which inner dimeter is about 0.36mm. 5％ formalin（50μl）was injected <?xml:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags" />s.c. into plantar suface of left hindpaw of the rats using a microsyringe with a 26－gauge needle，pain intensity scoring（PIS）was utilized to assess antinociceptive effect of morphine. And spleens were aseptically removed to obtain splenic cells. T lymphocyte function was evaluated based on Concanavalin－A（ConA）induced splenocyte proliferation. A modified lactic acid dehydrogenase（LDH）release assay was to assess NK cell activity.

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　　Result：（1）Compare with NS and sham group，morphine groups＇PIS is decreased markedly（P<0.01） in the early and late phase of formalin pain，and showing dose－dependent；（2）After pumping morphine 7 days，spleen index 、splenocyte proliferation induced by ConA and NK cell activity were significantly suppressed by intrathecal pumping morphine.

　　Conclusion：There was significant antinociception of intrathecal pumping morphine ，suppressed T lymphocyte proliferation and NK cell activity dose－dependently.

　　key words：Morphine；Intrathecal injection；T lymphocyte proliferation；Natural killer cell activity；Immunesuppression

　　吗啡是阿片样镇痛药的代表，研究表明吗啡对机体免疫有抑制作用，如抑制T淋巴细胞增殖水平、调节T淋巴细胞表面抗原的表达，抑制NK细胞活性等^[1，2]。但这些多是通过全身（腹腔、皮下）给药下得到的研究结果。吗啡鞘内给药是一个临床广泛使用的镇痛方式，但其对免疫功能的影响尚无定论。本研究拟在大鼠鞘内以不同速率持续泵入吗啡后，构建福尔马林炎性疼痛模型，观察其镇痛效果及对免疫功能的影响。 

材料与方法

　　主要仪器和试剂  Alezt泵（200μl，Model2001 美国），Microspinal导管（内径0.12mm，外径0.35mm，美国），β液体闪烁计数仪（LS6500，BECKMAN，美国），酶联免疫检测仪（ELx800UV，美国），二氧化碳培养箱（Queue，日本）。ConA（刀豆蛋白）（Vector，美国），3H－TDR（甲基－3H胸像嘧啶核苷）（中国科学院上海原子核研究所），LDH细胞毒试剂盒（Bivision 美国），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），D－hanks 、RPMI－1640（GIBCO，美国）。细胞株：小鼠淋巴瘤（YAC－1）细胞株（本学院免疫学教研室燕美玉老师惠赠）。

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　　方法  40只250～300g纯种清洁级雄性SD大鼠，随机分为5组（n＝8）：假手术组（F组）、生理盐水组（NS组），吗啡组按给药速率不同分为三个亚组，给药速率分别为2.5μg/h、5μg/h、10μg/h，记为M1、M2、M3组。大鼠腹腔注射10％的水合氯醛300～350mg/kg麻醉后，按改良Yaksh法^[3]鞘内置入Microspinal 导管至脊髓腰椎部（插入深度约8.5cm），逐层缝合伤口。F组即暴露寰枕膜并挑开，看到清亮的脑脊液，但并不置管。置管5天后Alzet泵注射吗啡、生理盐水，将泵容量调节器与聚乙烯管紧密相接，植入到大鼠背部皮下合适位置，鞘内持续泵入7d。大鼠处死前1h参照文献^[4]的方法进行福尔马林实验评估镇痛效果  将大鼠置于透明玻璃缸内，适应环境30min，用100μl微量注射器在大鼠左足跖皮下注射5％的福尔马林50μl。双盲法观察行为学变化，每5min记录一次，持续一小时。将大鼠炎性痛分为四级，0级：两后脚掌平放在地面，活动无异常；1级：注射脚掌轻微接触地面，活动时有跛行；2级：注射脚掌抬起，不接触地面；3级：大鼠舔咬或摇动注射脚掌。痛级（PIS）评分计算方法^[4]：PIS＝T₁＋2×T₂+3×T₃/5×60，其中T₁、T₂、T₃分别是5分钟内出现1、2、3级的时间。PIS评分后处死大鼠，用电子天平称取体重及脾脏重量，计算脾脏指数＝脾脏重量（mg）/体重（g）。

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