一 运用siRNA抑制DREAM基因表达的优点
         近来发现的DREAM(downstream regulatory element antagonistmodulator)为疼痛研究提供了新的靶点[1－3]。Cheng等[2]发现DREAM基因敲除后小鼠正常发育，未见运动技巧、协调、空间学习、记忆、心脏功能等方面的缺陷，但基础痛阈包括热痛、机械痛、Mg2SO4和酸溶液腹腔注射诱导的内脏痛，和病理痛模型包括福尔马林、辣椒素、角叉菜胶诱导的炎症痛和坐骨神经结扎的神经损伤性痛模型，痛行为测定显示痛觉反应明显降低，而且痛阈的降低不受刺激种类和组织类型的影响，故DREAM基因被认为是痛觉处理过程中关键的转录抑制子[4]。
        以往本研究组结果显示，鞘内注射反义DREAM寡核苷酸能抑制骨癌痛模型大鼠痛觉过敏，这种作用可能是通过下调脊髓DREAM的表达来发挥的。由于反义技术本身的限制，我们未能深入研究下调脊髓DREAM下调后内源性镇痛系统的变化，若使用siRNA（small interferencing RNA）技术就能继续下去，这是因为siRNA技术与其它几种进行基因功能丧失或降低突变技术相比，具有明显的优点[5]：首先，它比反义RNA技术和同源基因抑制更有效，能在低于反义核酸几个数量级浓度下，使目标基因降到极低水平。其次，与T-RNA技术造成的功能永久缺失相比，RNAi技术可随意控制抑制基因表达的时间。第三，与传统的同源重组基因敲除技术以及RNA/DNA嵌合分子介导的高效基因转变都只能一次改变一个基因相比，利用siRNA技术可以实现多种基因突变，这对DREAM及阿片肽家族的基因功能学研究提供了更为有效的方法。与激酶化学抑制剂相比，siRNA特异性更强，只抑制特定靶激酶的表达而不影响其它激酶的活性，从而为快速、准确地评定靶激酶的功能提供有力工具。
        RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指真核细胞中双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)介导的同源mRNA降解的一种高度保守的转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)[6]，是近年来产生的特异性高效基因阻断生物技术，是一种简单的代替基因敲除的分子生物学研究工具。RNAi作用的基本原理是一些双链siRNA（small interferencing RNA）结合一个核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC），激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上并切割它，从而阻断目的基因转录，并产生相应的功能表型缺失[7]。双链RNA(dsRNA)在体内无法稳定表达，人们发现短发夹样RNA(shRNA)可以发挥与双链RNA相同的作用，故目前研究集中在设计短发夹样RNA(short hairpin RNA，shRNA)序列，进而制备特异性siRNA。本研究组已经成功设计和制备用于抑制DREAM基因表达的shRNA，现介绍如下。

二 DREAM基因序列的确定
        在Genbank中页面，点击Search中的“CoreNucleotide”，在“for”后填写“DREAM”（见图1），点击“Go”即可见到DREAM相应的基因组数据库页面（见图1），共查找到相关的DREAM基因序列75种，其中人类(Homo sapiens )22种 、小鼠（Mus musculus）21种、犬狼属(Canis lupus familiaris)5种、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) 4种、(Drosophila pseudoobscura) 特异果蝇属3种、其他种属20种。我们通常是从人和鼠属来确定实验用的DREAM基因序列。

三 DREAM siRNA的设计

1. shRNA序列的排列顺序 

有关shRNA序列的排列主要考虑到发夹结构上下游信号的顺序，发夹结构是由茎环(loop)序列组成，且受pol III启动子控制^[8]。目前loop序列主要有两种，即5'-TTCAAGAGA-3’和5'-TTGATATCCG-3’。shRNA序列的排列顺序模式主要有两种，即：

模式1： 5'- BamH Ⅰ酶切位点（如GGATCCCG）＋反义序列＋loop（如TTGATATCCG）＋正义序列＋终止信号（如TTTTTT）＋HindⅢ酶切位点（如CCAAAAGCTT）-3’

模式2： 5'- Bgl Ⅱ酶切位点（如GATCCC）＋靶向正义链＋loop（如TTCAAGAGA）＋靶向反义链＋终止序列＋HindⅢ酶切位点-3’

 

2．shRNA序列的设计要点

为了获得具有良好干扰效果的shRNA，其序列的设计需遵守如下要点^[9-12]：（1）从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA重复)来设计。（2）避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。（3）siRNA序列的GC含量应为30%~50%左右。（4）在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区(untranslated regions, UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNA核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。（5）将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。（6）将潜在的序列和相应的基因组数据库(人，小鼠或大鼠等)进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列，例如使用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn进行同源对比。（7）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。（8）一个完整的siRNA实验应该有负对照。作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。

 

3. DREAM基因的siRNA设计

如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题。基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。目的基因序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同序列以决定何种序列是最有效的。基于质粒的RNAi干扰序列的选择随着启动子的不同会有不同的选择规则。目前基于DNA质粒的RNAi载体所使用的启动子主要有RNA三型启动子，如U6启动子、h-H 1和T7启动子。本研究组所使用的pDC316-EGFP-U6载体应用的就是U6启动子。

按照以上规则，本研究组根据GenBank中DREAM基因全长序列，在其开放阅读框架(open reading frame)的编码区内设计了4条干扰序列，基于人与小鼠的基因组数据库做BLAST查询，排除那些与DREAM以外基因有高度同源的序列，最后共筛选出位于DREAM基因cDNA上4个不同位点的片段用于设计siRNA序列，并进一步设计了4对体内表达: shRNA(short hairpin RNA)的寡核苷酸序列(由于申请的专利暂待批，故未列出序列)(图1-1)。方框中序列为茎环结构序列。将这些寡核苷酸单链合成后(其两端分别带有限制性酶切位点)，在体外加热-退火后，便可形成相应的双链DNA(dsRNA)。这便是要插入到pDC316-EGFP-U6载体中的片断。实验操作时可将其直接加入酶联反应体系中。

2．病毒载体系统
病毒载体因其对细胞天然的感染性而成为重要的基因导入手段。已经用于导入shRNA的病毒载体有逆转录病毒载体（包括慢病毒载体）、腺病毒载体和AAV载体等。用病毒载体携带shRNA（short hairpin RNA）转导可以克服人工合成的siRNA（small interfering RNA）的转导效率低、持续时间短等缺点，正在得到广泛的应用。
本研究组构建了腺病毒载体质粒（pDC316-EGFP-U6），其能表达shRNA的病毒载体的穿梭质粒，这种质粒携带了人U6启动子，同时还携带了EGFP表达单位，可在表达shRNA的同时表达EGFP，可实现实时荧光检测转导效率或用流式细胞仪分选转导阳性细胞。此病毒载体系统制备模式图如下。

参考文献
1. Carrion AM，LinkWA，Ledo F, et al. DREAM is a Ca2+-regulated transcriptional repressor. Nature,1999,398:80～84.
2. Cheng HY, Pitcher GM, Laviolette SR, et al. DREAM is a critical transcriptional repressor for pain modulation. Cell. 2002，108(1):31-43.
3. Costigan M, Woolf CJ. No DREAM, No pain. Closing the spinal gate. Cell. 2002，108(3):297-300.
4. Tu H, Juelich T, Smith EM, et al. Evidence for endogenous interleukin-10 during nociception. J Neuroimmunol. 2003，139(1-2):145-149.
5. Bernards R, Brummelkamp TR, Beijersbergen RL. shRNA libraries and their use in cancer genetics. Nat Methods. 2006 , 3(9): 701-706.
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7. Downward J. Science, medicine, and the future. RNA interference. BMJ, 2004, 328: 1246-1248.
8. Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science, 2002, 296(5567):550-553.
9. Pham JW, Sontheimer EJ. The Making of an siRNA. Mol Cell, 2004, 15: 163-171.
10. Tijsterman M, Plasterk Ronald HA. Dicers at RISC: The Mechanism of RNAi. Cell, 2004, 117: 1-4.
11. Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol, 2004, 22(3): 326-330.
12. Paddison PJ, Silva JM, Conklin DS, et al. A resource for large-scale RNA-interference-based screens in mammals. Nature, 2000, 428: 427-431.
13. Krom YD, Fallaux FJ, Que I, et al.Efficient in vivo knock-down of estrogen receptor alpha: application of recombinant adenovirus vectors for delivery of short hairpin RNA.BMC Biotechnol. 2006，6:11.

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